学术论文

      沙门菌属外膜蛋白免疫机制的研究

      目的: 研究沙门菌属外膜蛋白(OuterMembraneProtein,OMP)激化巨噬细胞的作用及对机体的免疫保护作用。 方法: 利用十二烷基肌氨酸钠法提取伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)、甲型付伤寒沙门菌(SalmonellaparatyphiA)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、肠炎沙门菌(Salmonella鲫teritidis)外膜蛋白,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析所提取的外膜蛋白的组分。冲洗小鼠腹腔,利用巨噬细胞贴壁生长的特性获得小鼠腹腔巨噬细胞;伤寒沙门菌外膜蛋白和伤寒沙门菌分别与小鼠腹腔巨噬细胞相互作用,检测不同时间点(2h、12h、24h、36h、48h)巨噬...
      目的: 研究沙门菌属外膜蛋白(OuterMembraneProtein,OMP)激化巨噬细胞的作用及对机体的免疫保护作用。 方法: 利用十二烷基肌氨酸钠法提取伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)、甲型付伤寒沙门菌(SalmonellaparatyphiA)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、肠炎沙门菌(Salmonella鲫teritidis)外膜蛋白,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析所提取的外膜蛋白的组分。冲洗小鼠腹腔,利用巨噬细胞贴壁生长的特性获得小鼠腹腔巨噬细胞;伤寒沙门菌外膜蛋白和伤寒沙门菌分别与小鼠腹腔巨噬细胞相互作用,检测不同时间点(2h、12h、24h、36h、48h)巨噬细胞分泌细胞因子IL-1α、TNF-α、IL-12的变化;预先用OMP刺激小鼠腹腔巨噬细胞,体外观察比较巨噬细胞内沙门菌存活数量。用鼠伤寒沙门菌OMP与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂制成乳油状,按照免疫程序多次多部位免疫新西兰兔,获得抗OMP抗体血清;以酶联免疫吸附法测定兔抗鼠伤寒沙门菌OMP抗体血清的效价;抗体血清以35%饱和硫酸铵溶液沉淀,以pH7.4的lOmMPBS透析纯化;蛋白免疫印迹法(Western-B10t)分析兔抗鼠伤寒沙门菌OMP抗体与伤寒沙门菌(5)~7monellatyphi)、甲型付伤寒沙门菌(SalmonellaparatyphiA)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)OMP抗原的反应特异性。采用Reed和Muench方法计算小鼠对鼠伤寒沙门菌的半数致死量(LD50)。小鼠经鼠伤寒沙门菌OMP免疫后,分别用100LD50、500LD50、1000LD50鼠伤寒沙门菌攻击小鼠,观察小鼠的存活率,分析鼠伤寒沙门菌OMP诱导小鼠的主动免疫保护;小鼠经兔抗鼠伤寒沙门菌OMP抗血清免疫后,分别用50LD50、100LD50鼠伤寒沙门菌攻击小鼠,观察小鼠的存活率,分析鼠伤寒沙门菌OMP诱导小鼠的被动免疫保护;小鼠经鼠伤寒沙门菌OMP免疫后,后足挚注射鼠伤寒沙门菌,观察小鼠足垫肿胀变化,分析鼠伤寒沙门菌OMP诱导小鼠的迟发性超敏反应情况。 结果: 1、伤寒沙门菌菌株、甲型付伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌外膜蛋白都具有多种组成成分,经SDS-PAGE分析,具有分子量大约为23KD、33KD、41KD、53KD的多条条带。 2、蛋白免疫印迹法(Western-Blot)分析显示兔抗鼠伤寒沙门菌OMP抗体与伤寒沙门菌、甲型付伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌OMP抗原在分子量大约为23KD具有共同的显色条带。 3、伤寒沙门菌OMP诱导巨噬细胞IL-1α、TNF-α、IL-12的分泌,并随时间而变化:IL-1α在36h达到分泌高峰,TNF-α在12h达到分泌高峰,IL-12在选定的最迟监测时间点(48h)仍呈上升状态;这与伤寒沙门菌刺激巨噬细胞后IL-1α、TNF-α、IL-12的变化有区别:IL-1α、TNF-α峰浓度有差异(p<0.05),IL-12达到峰浓度时间不同;伤寒沙门菌OMP与巨噬细胞作用后减少巨噬细胞内存活菌的数量(p<0.05)。 4、采用鼠伤寒沙门菌免疫新西兰兔可以获得效价为1:2048的兔抗鼠伤寒沙门菌OMP抗体血清。 5、按照Reed和Muench方法,小鼠对鼠伤寒沙门菌的半数致死量(LD50)为1.56×104CFU。 6、小鼠经鼠伤寒沙门菌OMP免疫后,能100%保护iOOLD50、500LD50的鼠伤寒沙门菌的攻击,甚至对1000LD50的鼠伤寒沙门菌的攻击的存活率也有83%(5/6)。 7、小鼠经抗鼠伤寒沙门菌OMP抗血清免疫后,能l00%保护50LD50、1OOLD50(最大试验菌落数)的鼠伤寒沙门菌的攻击。 8、小鼠经鼠伤寒沙门菌OMP免疫后,后足垫注射鼠伤寒沙门菌,24h足垫肿胀程度与对照组比较p<0.001,两组具有明显差异。 结论: 沙门菌属外膜蛋白具有能刺激巨噬细胞产生细胞因子,并激活巨噬细胞杀灭沙门菌的特性;通过动物接种可使被接种动物抵抗沙门菌的攻击,提示外膜蛋白具有免疫保护作用。
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      作者: 彭鹏
      学科专业: 临床检验诊断学
      授予学位: 硕士
      学位授予单位: 温州医学院温州医科大学
      导师姓名: 李向阳杨锦红
      学位年度: 2006
      语 种: chi
      分类号: R378.22 R392.11
      在线出版日期: 2007年7月25日