干細胞分化及其對急性肝衰竭大鼠治療的實驗研究

本研究旨在初步了解肝臟卵圓細胞的分化特性及其機理；尋找骨髓間充質干細胞體外誘導分化為肝細胞的更佳條件；探討骨髓間充質干細胞移植的更佳途徑，了解骨髓間充質干細胞移植治療急性肝衰竭的可行性。 方法:檢測細胞因子對肝干細胞的調控作用wBF-344細胞用不同濃度的細胞因子HGF、EGF、FGF、胰島素、IL-6、TNF-α作用，24小時后，通過H3TDR摻入法檢測細胞因子對肝干細胞增殖的影響；提取wBF-344細胞蛋白，用Westernblot方法檢測wBF-344細胞表面HGF受體(c-met)、EGF受體、FGF-α受體和TGF-β等受體蛋白的表達；WBF-344細胞體外誘導分化WBF-344細胞以5×103/孔接種于6孔培養板，8h后換分化培養體系：高糖DMEM、10％胎牛血清、HGF10ng～50ng/ml、EGF20ng/ml、Isulinlug/ml、地塞米松lμM。1-5天HGF用50ng/ml，以后改為10ng/ml維持，每3天半量換液一次，連續培養。在不同時間收集分化培養的細胞，提取mRNA，RT-PCR法檢測細胞表面ALB、AFPmRNA。取不同分化時間的細胞爬片標本，免疫組化法檢測分化細胞中ALB、AFP蛋白的表達。提取不同分化時間的細胞蛋白，Westernblot方法檢測細胞ALB、AFP蛋白的表達。 小鼠骨髓間充質干細胞的分離和培養取小鼠骨髓細胞懸液，用比重1.073的Percoll分離液分離(2000g，25min)單個核細胞，以5×104/孔，接種于直徑45mm的培養皿，37℃5％CO2條件培養。48h更換培養液，棄掉未貼壁細胞，每3天換液一次。細胞長到80％融合時胰酶消化傳代，以1：3比例傳代擴增培養。 體外誘導骨髓干細胞分化取新分離的骨髓單個核細胞，以5×104/孔接種于6孔細胞培養板，加分化培養體系：高糖DMEM、10％胎牛血清、100ng/mlHGF。每2天半量換液一次，連續培養，未行傳代。每天觀察細胞形態變化。對照組加等量培養液不加HGF，其他條件同實驗組。取不同分化時間細胞，提取細胞mRNA，半定量RT-PCR法檢測骨髓干細胞ALB、AFPmRNA的表達；取細胞爬片標本，免疫組化法檢測骨髓干細胞中ALB、AFP及CK19蛋白的表達； 檢測骨髓間充質干細胞中葡萄糖-6-磷酸酶的表達取誘導分化3周的骨髓間充質干細胞，洗滌兩次，加入孵育液(0.125％葡萄糖-6-磷酸鉀鹽，0.2mol/LTris馬來酸鹽，2％硝酸鉛)，置于37℃溫箱孵育20分鐘。蒸餾水洗滌2次，每次2分鐘。加入1％硫化氨，1分鐘后觀察細胞顯色。 提取并標記大鼠骨髓間充質干細胞1.073％Percoll分離骨髓單個核細胞，貼壁法對間充質干細胞進行純化，培養4周，傳代4次；DAPI標記細胞。7.建立2-AAF肝損傷及肝部分切除肝損傷大鼠模型；門靜脈和肝內分別移植107個骨髓間充質干細胞，并設立陰性對照組。 肝功能檢測細胞移植前及移植后1周及3周時，分別隨機取6只實驗鼠，心臟采血檢測血清白蛋白、谷丙轉氨酶及谷草轉氨酶。 熒光顯微鏡觀察移植后不同時間處死實驗鼠，分別取肝組織、肺組織和脾組織，制成5um冰凍切片，熒光顯微鏡觀察DAPI染色陽性細胞在不同組織中的分布。 免疫組化法檢測各種組織中SRY蛋白陽性細胞制作細胞移植后不同時間不同組織的冰凍切片，ABC法檢測組織中SRY蛋白陽性細胞。觀察分析陽性細胞的分布特征 巢式PCR法檢測SRY基因提取冰凍組織的基因組DNA。設計兩對引物，首先以外引物進行PCR，然后以首次PCR產物為模板，以內引物再次PCR，0.8％瓊脂糖電泳檢測。 組織病理觀察取細胞移植前后的肝組織，10％甲醛固定，石蠟切片，HE染色，觀察組織病理改變。 結果:wBF-344細胞高水平表達HGF受體(c-met)、EGF受體、FGF-α受體和TGF-β受體蛋白；HGF、EGF、FGF對wBF-344細胞具有促進增殖作用，并具劑量效應正相關；TGF-β則可抑制肝干細胞的生長，并可誘導wBF-344細胞發生凋亡；F-344細胞在體外能夠向肝細胞定向誘導分化。用含10％Fcs的DMEM、HGF、EGF、胰島素及地塞米松組成特異分化體系，對wBF-344細胞進行誘導分化，發現wBF-344可以向肝細胞分化。在誘導分化的不同時間點，提取RNA檢測細胞AFPmRNA和ALBmRNA的表達，發現作為干細胞標志物的AFP在分化過程中逐漸減少，在2周后不能測出。wBF-344細胞低水平表達ALB，但在培養分化2周后表達明顯增加。分化3周后，免疫組化法檢測提示細胞表達ALB和AFP蛋白。 骨髓間充質干細胞在完全培養液中培養72小時，去除未貼壁細胞，此時貼壁生長的骨髓間充質干細胞數量稀少，散在存在，多呈細而小梭形，隨著骨髓間充質干細胞的增殖，10天左右細胞生長達80％-90％融合，其形態呈較均一的長梭形。將這些細胞再傳代4次，細胞擴增近100倍，細胞形態未見明顯改變。用HGF誘導培養兩周時，細胞出現小梁樣排列，互相之間形成旋渦結構。2周后小梁結構漸清晰，誘導組中出現圓形細胞，呈克隆樣生長。非誘導組細胞未出現克隆樣生長，而出現骨小梁樣排列的細胞群。3周后誘導組梁樣結構逐漸模糊，圓形細胞死亡，細胞出現減少趨勢。非誘導組骨小梁樣結構進一步明顯。 半定量RT-PCR檢測發現，誘導1周時細胞表達少量ALBmRNA，3周時表達量最大，誘導2周后撤去HGF組，4周時未檢測到ALBmRNA，而誘導3周后撤去HGF組，4周時仍可檢測到ALBmRNA；非誘導組各時間段ALBmRNA始終陰性。新鮮分離的骨髓干細胞即表達少量的AFPmRNA，在誘導組分化2周時AFPmRNA表達量最大，以后逐漸減少；非誘導組AFPmRNA隨培養時間的延長逐漸減少，3周時幾乎測不出。 免疫組化檢測發現誘導3周時，細胞ALB及AFP蛋白染色均呈陽性，細胞中ALB、AFP蛋白主要分布在細胞質中。CK19染色始終為陰性。經3周誘導培養，誘導組骨髓干細胞呈葡萄糖6磷酸酶陽性，而未誘導組陰性。 2-AAF處理10天時，大鼠體重明顯減輕，瞼結膜、鼻腔粘膜及唇周有出血。 2-AAF肝損傷大鼠，骨髓間充質干細胞移植3周時，細胞移植組血清白蛋白明顯高于陰性對照組(P＜0.05)，經門靜脈和肝內注射兩種移植方式結果相似；肝部分切除肝損傷大鼠，經門靜脈細胞移植后48小時細胞移植組血清谷丙轉氨酶明顯低于陰性對照組，P＜0.05。兩種移植方式進行比較發現，移植后3周肝內注射移植組血清白蛋白明顯高于經門靜脈移植組。 骨髓間充質干細胞移植后的體內分布研究顯示：A、熒光顯微鏡觀察發現不同的移植方式對移植后細胞的分布無明顯影響。移植1周時，肝臟、肺臟以及脾臟中都可觀察到DAPI標記的細胞。移植后3周時，2-AAF肝損傷大鼠的肝內可見3-6個DAPI陽性細胞組成的細胞簇，此細胞形態與正常肝實質細胞很相似；而在肝部分切除肝損傷大鼠，僅觀察到單個或2-3個DAPI陽性細胞組成的細胞簇。此時正常肝臟、肺臟及脾臟中很少見到DAPI標記的細胞。B、免疫組化檢測細胞移植后不同組織中的SRY蛋白陽性細胞，結果發現移植后1周時肝組織包括正常肝組織與損傷肝組織以及肺組織、脾組織中均存在SRY陽性細胞，但肝組織中的陽性細胞數明顯高于脾組織和肺組織。移植3周，正常肝組織、肺組織、脾組織很少見到陽性細胞，而損傷肝組織中仍存在部分陽性細胞。在2-AAF肝損傷組可見到4個以上成簇排列的陽性細胞；而肝部分切除組，陽性細胞多以單個存在，很少見到4個以上的陽性細胞簇。C、巢式PCR法檢測各種組織中的SRY基因，發現細胞移植1周，在受體鼠的肝、肺以及脾組織中均可檢測到SRY基因。移植3周時，僅在損傷的肝組織中檢測到目的片段，并發現經門靜脈移植和肝內直接移植結果相似。 肝組織病理檢查提示2-AAF可導致肝組織彌漫性損傷，鏡下可見細胞點狀壞死，腫脹呈氣球樣變。肝部分切除后即時肝組織無明顯異常。細胞移植后隨著時間延長，肝組織病變逐漸改善。 結論:大鼠肝干細胞系WBF-344細胞高水平表達HGF受體(c-met)、EGF受體、FGF-α受體和TGF-β受體蛋白。HGF、EGF、FGF對WB-F344細胞具有促進增殖作用，并具有劑量效應正相關。TGF-β則可抑制肝干細胞的生長。 在特定的分化條件下，WBF-344細胞在體外能誘導向肝細胞分化。 HGFl00ng/ml體外可以誘導骨髓間充質干細胞表達ALB及AFP，但不能誘導其表達CK19；HGF體外誘導骨髓間充質干細胞向肝細胞分化的最佳時期為2-3周；骨髓間充質干細胞的分化是不可逆的，誘導分化3周時，骨髓間充質干細胞表現出肝細胞的部分功能特征。 大劑量2-AAF可造成大鼠肝組織彌漫性損傷，異體骨髓間充質干細胞移植對2-AAF所致肝損傷有一定的治療作用。肝內注射移植對2-AAF所致肝損傷的治療作用似乎優于經門靜脈移植。 細胞移植治療肝損傷的療效與肝損傷本身的性質有關，對物理性的肝損傷療效不顯著。 骨髓間充質干細胞經門靜脈或肝內注射移植后，受體鼠各臟器中均有移植細胞存在，3周后大多數移植的骨髓間充質干細胞歸巢，僅在肝損傷大鼠的肝內仍有少量移植細胞存在，形態似肝實質細胞。 體外傳代培養的骨髓間充質干細胞具有免疫耐受性，不易引起免疫排斥反應，可用于異體移植來治療肝衰竭。