PCR技術在黑木耳交配型因子研究中的應用

黑木耳(Auriculariaauricula)是一種栽培歷史悠久，深受消費者歡迎的食用菌，具有重要的藥用滋補功能。 采用原生質體單核化技術分別獲得黑木耳栽培菌株He-1和Ju-1的單核體H2和J3，H2和J3雜交配對形成雙核體H2J3。H2J3經栽培出耳后，獲得其子實體，通過單孢分離技術獲得F1子代59個單核體。 根據交配型將F1代單核體菌株分成兩個群(A1和A2)，在每群內各抽出10個菌株分別組成A1和A2兩個等基因池。同時根據高等真菌中信息素前體羧端的CAAX模體及A座位同源結構域中保守氨基酸序列設計了176種特異性單引物。PCR擴增結果表明，僅引物XY161可以擴增得到一條僅在A1池中出現的特異標記帶XY1611462。將該特異帶克隆、測序，分析其序列結構，結果顯示該標記極可能位于信息素基因的下游端；利用BLAST程序搜索同源序列，沒有比對出同源的DNA序列，但其蛋白質序列比對出同源結構域，表明該標記片段可能編碼短鏈脫氫酶，表現出與糙皮側耳(Pleurotusostreatus)和新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)等異宗結合擔子菌類似的特征。該結果表明交配型座位內的DNA序列變化較大，但其編碼的蛋白質結構類似。 根據裂褶菌STE3信息素受體中的保守氨基酸序列設計的簡并引物br1-F和br1-R，可以在親本菌株H2和24個F1子代單株中擴增得到一條811bp的特異帶，其中包括F1代9個H2型單株(占供試菌株的15.3％)和15個J3型菌株(占供試菌株的25.4％)。將在H2型菌株59號和J3型菌株45號中擴增得到的特異帶進行克隆和測序，運用BLAST搜索同源序列，其DNA序列比對不出同源序列，但其蛋白質序列可以比對出同源結構域——STE3信息素受體，總共搜索到92個同源序列，e值大小從2e-35到8.1；BLAST搜索結果表明，該信息素受體片段更加類似于四極性擔子菌。序列分析發現，該片段可能包含4個內含子。SOSUI程序預測該片段編碼的蛋白質是具有5個跨膜結構域的膜蛋白。該信息素受體基因片段在子代中表現了極高的重組率，表明該信息素受體基因因與交配型無關，從而表現為不連鎖，該結果與二極性食用菌滑菇(Pholiotanameko)類似。 MIP基因與多種同擔子菌(Homobasidiomycete)的A交配型座位緊密連鎖，根據MIP蛋白(Mitochondrialintermediatepeptidase)設計了6對簡并引物。MIP系列引物可以在多種同擔子菌中擴增出特異帶，而在異擔子菌(Heterobasidiomycete)中不能擴增出任何特異帶，在黑木耳中運用MIP系列引物也不能擴增出任何特異帶，這與黑木耳屬于典型的異擔子菌完全相符。